Współczesne procedury i standardy diagnostyki kłębuszkowych zapaleń nerek. Praca finansowana z grantu MNiSW: N N402 088735

1. Cele biopsji nerki

Biopsja nerki jest podstawowym badaniem diagnostycznym pozwalającym na uzyskanie informacji o rodzaju, aktywności i zaawansowaniu procesu chorobowego. Należy podkreślić, że biopsja nerki jest zasadna, jeśli dostarcza informacji istot­nych diagnostycznie i prognostycznie, ale przede wszystkim powinna być wykonana w przypadkach, kiedy rodzaj postępowania terapeutycznego jest ściśle uzależniony od wyniku mikroskopowej oceny biopunktatu.

2. Wskazania do wykonania biopsji nerki

Podstawowe wskazania do wykonania biopsji nerki przedstawia Tabela I. Biopsja nerki jest cennym zabiegiem diagnostycznym, jednak istnieje ryzyko wystąpienia powikłań. W każdym przypadku należy rozważyć, czy korzyści przewyższają zagrożenia. Badania prospektywne wykazały, że wynik biopsji nerek zmienia wstępne rozpoznanie w 44% przypadków, prognozę dokonaną na podstawie oceny klinicznej w 57% przypadków, a postępowanie terapeutyczne w około 30% przypadków. Największe rozbieżności pomiędzy klinicznym rozpoznaniem a rozpoznaniem dokonanym na podstawie mikroskopowej oceny biopunktatu dotyczą glomerulopatii, które klinicznie manifestują się zespołem nerczycowym lub ostrą niewydolnością nerek. W ostrej niewydolności nerek rozbieżność pomiędzy klinicznym rozpoznaniem a histopatologicznymi zmianami w biopunktacie sięga nawet 50%. U chorych na cukrzycę biopsja nerki jest wykonywana jedynie w 10% przypadków, choć histopatologiczne badanie biopunktatu aż u około 2/3 chorych ujawnia inne zmiany niż cukrzycowa choroba nerek. Wykonanie biopsji nerek u chorych na cukrzycę należy rozważyć w przypadku utrzymującego się krwinkomoczu, zespołu nefrytycznego, gwałtownego pogorszenia funkcji nerek, szczególnie u pacjentów chorych na cukrzycę typu 1, u których nie stwierdza się cech retinopatii.

Tabela I. Wskazania do wykonania biopsji nerki

Zespół nerczycowy

Bezobjawowy białkomocz

Krwinkomocz lub krwiomocz trwały lub epizodyczny o niejasnej etiologii

Ostra niewydolność nerek

Przewlekła choroba nerek (poza schyłkową niewydol­nością nerek)

Nefropatie w przebiegu chorób układowych (np.: toczeń układowy, reumatoidalne zapalenie stawów)

3. Przeciwwskazania do wykonania biopsji nerki

Większość przeciwwskazań do wykonania biopsji nerki (Tabela II) ma charakter względny. W miarę postępu medycyny zmniejsza się ryzyko związane z zabiegiem. Nadciśnienie tętnicze, zaburzenia krzepnięcia czy niedokrwistość moż­na dzięki właściwej terapii opanować przed zabiegiem.

Tabela II. Przeciwwskazania do wykonania biopsji nerki

Brak jednej nerki

Brak współpracy ze strony pacjenta

Wielotorbielowatość nerek

Skaza krwotoczna

Nowotwory nerek

Ciężkie niewyrównane nadciśnienie tętnicze

Mnogie tętniaki tętniczek nerkowych

Wodonercze

Schyłkowa niewydolność nerek (w ocenie ultrasonograficznej grubość miąższu nerki < 10 mm)

Zmiany ropne nerek lub tkanek otaczających

Niedokrwistość znacznego stopnia

Otyłość znacznego stopnia

Niewyrównana mocznica

Niemożliwe do wyrównania zaburzenia krzepnięcia krwi

 

4. Powikłania po biopsji nerki

Przezskórna biopsja nerki jest bezpiecznym zabiegiem diagnostycznym, a poważne powikłania zdążają się bardzo rzadko. Powikłania stwierdzane po biopsji nerki przedstawia  Tabela III. Ryzyko nefrektomii z powodu powi­kłań po biopsji nerki ocenia się na 0.1-0.2%,  zaś ryzyko zgonu po zabiegu na 0.02-0.05%.

Tabela III. Powikłania po  biopsji nerki

Krwinkomocz - stwierdzany prawie w każdym przypadku (95-100%)

Krwiomocz (5.0-9.0%)

Krwiaki nadtorebkowe (64-81%) i podtorebkowe (3.3-4.0%)

Przetoka tętniczo-żylna (15-17%)

Krwawienie do przestrzeni zaotrzewnowej

Masywne krwawienie do układu kielichowo-miedniczkowego <0.5%

Nasilony ból po biopsji

Powikłania infekcyjne - 0.2%

5. Zasady pobierania, utrwalania i przesyłania biopunktatu do laboratorium histopatologicznego

Materiał diagnostyczny może pochodzić z gruboigłowej biopsji przezskórnej wykonanej pod kontrolą USG (najczęściej) lub tomografu komputerowego, biopsji chirurgicznej (otwartej i laparoskopowej) oraz biopsji przezżylnej. Nakłucia nerki dokonują nefrolodzy, urolodzy lub radiolodzy.

Zalecane jest pobieranie co najmniej dwu biopunktatów, z których jeden należy w całości przeznaczyć do badania w mikroskopie świetlnym, a drugi do oceny immunomorfologicznej i badań w mikroskopie elektronowym. Używając lupy lub mikroskopu należy ocenić czy biopunktat zawiera kłębuszki i dokonać podziału materiału tkankowego. W tym celu uzyskany drogą nakłucia materiał tkankowy należy delikatnie przenieść na szkiełko podstawowe i zalać niewielką ilością soli fizjologicznej. W powiększeniu lupowym kłębuszki widoczne są w biopunktacie w postaci okrągłych czerwonych kul. Dokonując podziału biopunktatu należy przeznaczyć 70% tkanki do badania w mikroskopie świetlnym, 20% do badań immunofluorescencyjnych, a 10% do oceny w mi­kroskopie elektronowym. Jeżeli nie można dokonać oceny materiału tkankowego należy z obu końców odciąć po 1mm2 biopunktatu z przeznaczeniem do mikroskopii elektronowej, następnie większy fragment utrwalić do badań w mikroskopie świetlnym, a pozostały mniejszy przeznaczyć do badania immunomorfologicznego. Jeżeli materiał tkankowy uzyskany drogą nakłucia jest bardzo skąpy, podział biopunktatu, a zatem również zakres wykorzystywanych technik uwzględniać powinien wstępną diagnozę kliniczną.

Konieczne jest ścisłe przestrzeganie procedur właściwego za­bezpieczenia i przesyłania materiału biopsyjnego do oceny patomorfologicznej. Sposób zabezpieczenia materiału tkankowego zależy od tego, w jakim czasie ma on szanse dotrzeć do pracowni histopatologicznej. Materiał nieutrwalony powinien tam trafić najpóź­niej 15-20 minut od pobrania. Jeśli czas transportu ocenia się na 2-3 godziny, nieutrwalony materiał tkankowy natychmiast po pobraniu należy umieścić na bibule filtracyjnej obficie nasączonej solą fizjologiczną i przesłać do pracowni histopa­tologicznej w zamkniętej płytce Petriego obłożonej lodem. Podczas transportu temperatura przechowywania biopunkta­tu nie powinna przekraczać 15°C, a materiał tkankowy nie może ulec wysuszeniu. Jeżeli biopunktat nie może być do­starczony w czasie 2-3 godzin, powinien być natychmiast po pobraniu utrwalony we właściwych utrwalaczach, dostarczo­nych przez laboratorium patomorfologiczne.

Niewłaściwe utrwalenie ma­teriału biopsyjnego jest przyczyną artefaktów utrudniających lub wręcz uniemożliwiających diagnostykę mikroskopową. Do mikroskopii świetlnej najlepszym utrwalaczem jest 4% roztwór zbuforowanego formaldehy­du, do mikroskopii elektronowej - roztwór aldehydu gluta­rowego w buforze kakodylowym, zaś badanie immunofluorescencyjne przeprowadza się na skrawkach nieutrwalonych.

6. Reprezentatywność materiału diagnostycznego

Uważa się, że biopunktat jest miarodajny, jeżeli materiał tkankowy przeznaczo­ny do mikroskopii świetlnej zawiera, co najmniej 10 kłębuszków i 1 przekrój przez tętnicę, do badań immunomorfologicznych - 5 kłębuszków, a do badań ultrastrukturalnych, - co najmniej 2 kłębuszki. Należy jednak podkreślić, że diagnostyka kłębuszkowych zmian ogniskowych wymaga obecności, co najmniej 20 kłębuszków w biopunktacie.

Według standardów zalecanych przez Nephropathology Working Group diagnostyka zmian w pętlach włośniczkowych wymaga fragmentu kory o powierzchni większej niż 2 mm2 i obecności więcej niż 5 kłębuszków. Do oceny zmian cewkowo-śródmiąższowych powierzchnia kory nerki powinna przekraczać 3 mm2, a liczba kłębuszków powinna być większa niż 8. Procentowa ocena liczby kłębuszków całkowicie stwardniałych i kłębuszków zawierających półksiężyce jest wiarygodna, jeżeli powierzchnia kory nerki przekracza 5 mm2, a biopunktat zawiera, co najmniej 13-15 kłębuszków. 

7. Metody morfologicznej diagnostyki biopunktatu nerki

Oceny materia­łu biopsyjnego dokonuje doświadczony patomorfolog posługując się mikroskopią świetlną, immunofluorescencją i mikroskopia elektronową. Według aktualnych standardów, patomorfolog zdobywa doświadczenie w nefropatologii, jeżeli ocenia rocznie, wszystkimi trzema metodami, co najmniej 200 biopunktatów nerek. Konfrontacja zmian morfologicznych z klinicznym przebiegiem choroby wymaga od patomorfologa wiedzy z zakresu kliniki chorób nerek.

7.1. Mikroskopia świetlna.

Ocenie w mikroskopie świetlnym poddaje się łącznie około 25-50 seryjnych skrawków z różnych poziomów biopunktatu umieszczanych na kolejno numerowanych szkiełkach. Grubość skrawków nie powinna przekraczać 2-3 μm, jedynie do oceny amyloidu stosuje się skrawki grubsze niż 5 μm. Ruty­nowo przeprowadza się następujące barwienia histochemiczne:

1.     Barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E, barwienie przeglądowe).

2.     Barwienie wg metody trójbarwnej Masson'a pozwalające na wybiórczą ocenę ognisk stwardnienia kłębuszków i włók­nienia śródmiąższowego, obecności skrzeplin i martwicy włóknikowatej.

3.     Srebrzenie wg metody Jones'a pozwalające na ocenę błon podstawnych, naczyń, ognisk stwardnienia w kłębuszkach.

4.     Odczyn PAS (Periodic Acid Schiff) umożliwiający ocenę błon podstawnych, terenu mezangium i naczyń.

5.     Barwienie czerwienią Kongo na amyloid i ocena w świetle spo­laryzowanym.

 

W diagnostyce histopatologicznej przydatne jest również barwienie AFOG (Acid fuchsin orange G) umożliwiające ocenę kompleksów immunologicznych, które barwią się na kolor czerwony.

7.2. Badanie immunomorfologiczne

Ocena immunomorfologiczna stanowi niezbędny składnik diagnostyki kłębuszkowych chorób nerek. Badanie immunofluorescencyjne wymaga materiału tkankowego nieutrwalonego. Na skrawkach grubości 3-4 μm uzyskanych przy pomocy kriostatu wykonuje się immunofluorescencję bezpośrednią z przeciwciałami sprzężonymi najczęściej z fluoresceiną (FITC). Za dodatni wynik odczynu przyjmuje się wyraźne zielone świecenie, natomiast żółtawe świecenie jest najczęściej związane z autofluorescencją składników strukturalnych nerki, lub kropli tłuszczu i stanowi artefakt.

Standardowy zestaw do immunomorfologicznej diagnostyki kłębuszkowych chorób nerek obejmuje wykonanie odczynów z przeciwciałami skierowanymi przeciwko IgG, IgA, IgM, C3, C1q, fibrynogenowi, albuminie, łańcuchom lekkim lambda i kappa. W przypadku podejrzenia nefropatii w zespole Alporta dodatkowo wykonuje się odczyny z przeciwciałami skierowanymi przeciwko łańcuchom α kolagenu IV. W diagnostyce amyloidozy, glomerulopatii fibronektynowej, glomerulopatii kolagenu III stosuje się odczyny z przeciwciałami skierowanymi przeciwko białkom prekursorowym amyloidu, fibronektynie i kolagenowi III. W każdym przypadku obowiązuje wykonanie kontroli negatywnej i pozytywnej.

Badanie immunomorfologiczne obejmuje ocenę jakościową oraz półilościową ocenę natężenia świecenia, najczęściej w skali od 0 do +4. Zalecana jest archiwizacja fotograficzna wszystkich dodatnich wyników badania immunofluorescencyjnego. W przypadku ograniczonej ilości ma­teriału diagnostycznego badanie immunofluorescencyjne może być wykonane na skrawkach parafinowych lub meto­dą immunoenzymatyczną, po uprzednim trawieniu proteolitycznym tkanek. Zaletą techniki immunoenzymatycznej jest możliwość zastosowania do materiału archiwalnego i niewielki koszt w porównaniu do badania immunofluorescencyjnego, ponieważ nie wymaga ona dodatkowego kosztownego wyposażenia (mikroskop fluorescencyjny). Metoda immunoenzymatyczna nie wymaga pobrania dodatkowego fragmentu tkankowego, odczyny są trwałe i łatwe do archiwizacji.  Wadą techniki immunoenzymatycznej jest mała powtarzalność odczynów oraz znaczne podbarwienie tła utrudniające interpretację odczynów.

Na ogół uważa się, że metodyka immunofluorescencyjna jest bardziej wiarygodna niż metodyka immunohistochemiczna w diagnostyce kłębuszkowych chorób nerek

7.3. Mikroskopia elektronowa

Według aktualnych standardów optymalne byłoby wyko­nywanie badania ultrastrukturalnego w każdym przypadku. Ze względu jednak na koszty zaleca się zabezpieczanie materiału w bloku eponowym i uzależnie­nie decyzji o wykonaniu oceny w mikroskopie elektronowym od danych klinicznych oraz wyniku badania w mikroskopie świetlnym i fluorescencyjnym.

Optymalny fragment tkankowy przeznaczony do badań ultrastrukturalnych nie powinien być większy niż 1x1x1 mm. Najczęściej używanym utrwalaczem jest 3% roztwór zbuforowanego glutaraldehydu, albo 2.5% roztwór glutaraldehydu w buforze kakodylowym.  Następnie materiał dotrwala się w 1% roztworze czterotlenku osmu i zatapia w bloki eponowe. Barwione błękitem toluidyny skrawki grubości 1μm (skrawki „półcienkie") ocenia się w mikroskopie świetlnym wybierając fragment tkankowy do badania ultrastrukturalnego.  Następnie sporządzane są skrawki ultracienkie kontrastowane octanem uranylu i cytrynianem ołowiu. Oceny ultrastrukturalnej dokonuje się w małym, średnim i dużym powiększeniu.

W przypadkach, gdy nie został zabezpieczony fragment biopunktatu do oceny ultrastrukturalnej, lub gdy fragment tkankowy zabezpieczony do badania w mikroskopie elektronowym nie zawiera kłębuszków można wykorzystać materiał parafinowy, stosując odpowiednią technikę przygotowania skrawków. Należy jednak pamiętać, że ultrastrukturalna ocena biopunkatu utrwalonego w formalinie często nie pozwala na jednoznaczną interpretację zmian o niewielkim nasileniu.

8. Współpraca klinicysty i patomorfologa w diagnostyce kłębuszkowych chorób nerek

W każdym przypadku patomorfolog oceniający biopunkat nerki powinien dysponować danymi klinicznymi i wynikami ba­dań laboratoryjnych pacjenta.

Do materiału biopsyjnego musi być dołączone skierowanie za­wierające informacje dotyczące: wstępnego rozpoznania klinicznego, przebiegu choroby, danych z wywiadu rodzinnego, odchyleń w badaniu ogólnym moczu, wydolności nerek (stężenie kreatyniny w surowicy, eGFR), tempa progresji niewydolności nerek, wartości ciśnienia tętniczego, zakażenia wirusami (HBV, HCV, HIV, CMV), miana przeciwciał ANCA, przeciwciał ANA, obecności białka monoklonalnego w surowicy i/lub moczu, współistniejących chorób metabolicznych (cukrzyca, otyłość) i dotychczasowego leczenia. Należy dążyć, aby interpretacja obra­zu mikroskopowego odbywała się na zasadzie konfrontacji morfologiczno-klinicznych z udziałem nefropatologa i ne­frologa, najlepiej przez organizowanie okresowych spotkań, podczas których mikroskopowe zmiany w biopunktatach konfrontowane są z obrazem klinicznym.

Morfologiczne zmiany opisane przez patomorfologa powinny być dla nefrologa wskazówką dotyczącą przewi­dywanego tempa progresji uszkodzenia nerki i odwracal­ności zmian. Nefrolog powinien znać możliwości i ograniczenia technik mikroskopowych stosowanych przez patomorfologa oraz umieć interpretować dane zawarte w opisie zmian morfo­logicznych.

 

powrót

Copyright @ CKD 2009